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Jul 27, 2023

ペプチド

Ingegneria Biomedica della Natura

Nature Biomedical Engineering volume 7、pages 647–660 (2023)この記事を引用

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155 オルトメトリック

メトリクスの詳細

CRISPR を介した初代ヒトリンパ球のゲノム編集は通常エレクトロポレーションによって行われますが、これは細胞毒性があり、煩雑で費用がかかる可能性があります。 今回我々は、スクリーニングによって同定された両親媒性ペプチドと混合したCRISPRリボ核タンパク質を送達することにより、編集された初代ヒトリンパ球の収量が大幅に増加できることを示す。 私たちは、Cas9 または Cas12a リボ核タンパク質、またはアデニン塩基エディターの送達を介して T 細胞、B 細胞、およびナチュラルキラー細胞の遺伝子をノックアウトすることにより、この簡単な送達法のパフォーマンスを評価しました。 また、アデノ随伴ウイルス媒介相同性指向修復テンプレートと組み合わせたペプチド媒介リボ核タンパク質送達により、T細胞受容体α定常遺伝子座にキメラ抗原受容体遺伝子を導入できること、および改変された細胞が抗腫瘍効力を示すことも示す。ネズミ。 この方法は混乱が最小限に抑えられ、専用のハードウェアを必要とせず、逐次配信による多重編集と互換性があるため、遺伝毒性のリスクが最小限に抑えられます。 ペプチドを介したリボ核タンパク質の細胞内送達は、改変された T 細胞の製造を促進する可能性があります。

効率的で拡張性があり、混乱を最小限に抑えた自家および同種改変 T 細胞の製造は、効果的で利用しやすい細胞療法の開発において依然として中心的な課題です。 遺伝子操作された免疫細胞は、がん、感染症、遺伝性疾患、自己免疫疾患を治療するための臨床試験に入っています 1 が、細胞治療パイプラインにおける製造障壁は依然として存在しており、これらの製品の費用対効果の高い開発が妨げられています。 正確な T 細胞操作には、レンチ ウイルスまたはガンマレトロ ウイルス (gRV) ベクターとの擬似ランダム統合よりも優れた利点があります 2,3 が、ex vivo でクラスター化された規則的に間隔をあけられた短いパリンドローム リピート (CRISPR) を介したヒトリンパ球のゲノム編集の一般的な送達戦略はエレクトロポレーションに依存しています。これは、細胞治療パイプラインにおける細胞毒性、コスト、製造負担の大きな原因となっています4。 ペプチドを利用した細胞への送達は、培養細胞に適用する前にゲノム編集カーゴと混合するだけの低コスト試薬を使用する魅力的な代替手段です。 毒性が適切に低いため、このアプローチは、精密なノックイン編集とノックアウト編集の組み合わせを特徴とする次世代細胞療法を製造するための精密なゲノム工学の一連のラウンドを容易にする可能性があるが、これまでのところ、ペプチドベースの送達は、ヒト一次免疫細胞における有用性が限られていることが示されている。

高分子カーゴを細胞に送達するためのペプチドの使用は、主に、HIV-1 の TAT 配列などの高カチオン性細胞透過ペプチド (CPP) に焦点を当ててきました。 CPP は、融合または結合した積荷の膜移行を促進するのに効果的な場合が多いものの、多くの治療に関連する細胞型では毒性があるため、使用が制限されています 6。 インフルエンザ由来の HA2 などのエンドソーム溶解ペプチドは通常両親媒性であり、pH 依存性の立体構造変化 7 を起こし、エンドソーム膜の破壊と関連する積荷のサイトゾルへの脱出を引き起こします。 HA2 のような配列は、それ自体では疎水性および不溶性が高すぎるため、簡単に適用するには 8 、生化学的特性を改善するにはさらなる工学的操作が必要です。 HA2 由来のエンドソーム溶解ペプチドと TAT などのカチオン性 CPP の融合を含むキメラペプチドは、エンドソーム溶解機能を保持し、高分子送達を向上させることができます9。 例えば、キメラ HA2-TAT 融合配列 (INF7-TAT および E5-TAT を含む) に由来する配列は、低分子干渉 RNA の無毒性送達に使用されています 10。 HA2-TAT ペプチドとその誘導体は、非共有結合を通じて他の高分子と会合することができ、簡単な共インキュベーションと細胞への適用により、関連するカーゴの形質導入を促進します9。

CRISPR 試薬を送達するための非ウイルス法の現在の限界を考慮して、我々は、短鎖干渉 RNA を送達することが以前に報告されているペプチドをスクリーニングし、CRISPR リボ核タンパク質 (RNP) とのペプチドの適合性を調査し、初代ヒト免疫細胞を操作する際の有効性を最適化することに努めました。 この記事では、ゲノム編集試薬を初代ヒトリンパ球に送達するための便利で効果的な戦略を報告します。この戦略では、CRISPR RNPをペプチド試薬と単純に混合し、ex vivo培養中の細胞に適用します（図1a）。 このアプローチ (ここでは CRISPR エンジニアリング用ペプチド有効 RNP 送達 (PERC) と名付けています) は、他の送達技術に比べて複数の利点を持つ、高効率で正確な多重 T 細胞エンジニアリングを仲介します。 PERC は、専用のハードウェアを必要とせずに、初代 T 細胞における無毒で摂動を最小限に抑えたゲノム編集を容易にし、より面倒な送達技術が実現できない環境でのポイントオブケア細胞療法の製造を可能にする可能性があります。

a、ペプチドを利用したRNP送達のための戦略。 ペプチドをあらかじめ形成された RNP と混合して結合させ、その混合物を初代ヒト T 細胞に適用します。 b, 試験したペプチド配列。 インフルエンザ HA2 配列は、TAT 融合誘導体 INF7-TAT および E5-TAT、および A5K ペプチドと比較されます。 相違点は太字で示しています。 c、ペプチドまたはエレクトロポレーション（e-por）によって促進される、CD4+ T細胞へのCas9 TRAC-RNP送達。 送達の4日後に、TCR表面発現についてフローサイトメトリーによってノックアウト効率をアッセイした。 nt は未処理であり、mock は DMSO のみかエレクトロポレーション済み (RNP なし) です。 総細胞生存率は 2 日目に評価され、相対光単位 (RLU) で報告されます。 P 値は、分散分析およびホルム・シダック多重比較検定から得られます。 d、CAR AAV HDRTの有無にかかわらず、PERCまたはエレクトロポレーションによって送達されたCas9またはCas12a TRAC-RNPを使用したCD3+ T細胞の編集。 n = 3 つの異なるヒトドナーからの生物学的複製。 棒は平均を表します。 エラーバーは標準誤差を表し、P 値は両側ウェルチの不対 t 検定およびホルム・シダック多重比較検定からのものです。

ソースデータ

核局在化シグナル（NLS）に富んだ化膿連鎖球菌Cas9コンストラクト11を使用して、HA2-TAT融合足場に由来する37個の両親媒性ペプチドのパネル（図1bおよび補足表1）を評価し、Cas9 RNPの送達を促進する能力を評価しました。初代ヒトCD4 + T細胞のB2M遺伝子座の編集（補足図1）。 各ペプチドをあらかじめ形成された RNP と 20:1 のモル比 (ペプチド:RNP; 初期の経験的スクリーニングを使用して決定) で混合し、混合物を培養細胞に適用し、3 日後にアンプリコンを使用して B2M 遺伝子座でのゲノム編集を評価しました。挿入と欠失（インデル）を検出するための次世代シーケンシング（NGS）（補足図1a）と、両対立遺伝子ノックアウト後のB2M表面発現の損失を検出するためのフローサイトメトリー（補足図1b）に基づいています。 このスクリーニングにより、いくつかの有望なペプチドが同定され、INF7-A5K-TAT (「A5K」、全体で緑色で示されている) はゲノム編集を促進するのに最も強力であり、高い編集細胞収量を生み出すのに最も安定しています。

T 細胞受容体 (TCR) α 定常 (TRAC) 遺伝子座 (以降「TRAC-RNP」) を標的とする Cas9 RNP を使用して、フローサイトメトリーを使用して、A5K の活性を、A5K の送達を促進することが知られている他の両親媒性ペプチドの活性とさらに比較しました。高分子カーゴ、たとえば、HA2-TAT誘導体E5-TAT9,12およびINF7-TAT13,14,15（図1cおよび補足図2）。 スクリーニングされたペプチドの中で、A5K は再び最も高い活性を示しました。T 細胞での RNP 送達に最適化されたエレクトロポレーション プロトコールを使用した場合のノックアウト 99% と比較して、ノックアウト 68% でした 16。 また、ナチュラルキラー（NK）細胞へのCas9 RNP送達を促進することが以前に報告されているペプチド6HCM18PTD4もテストしました17が、治療期間を短縮しても編集効率が低く、実質的な毒性が観察されました（図1cおよび補足図3）。 ペプチド ppTG21 は、肝癌細胞への Cas9 RNP のリガンド媒介送達を助けることが以前に報告されていました 18 が、T 細胞では効率が非常に低いことが観察されました。 ジメチルスルホキシド (DMSO; ペプチドストックの溶媒) と RNP を含むコントロール条件では、名目上のゲノム編集頻度が示されました。これは、NLS に富む Cas9 が自身の細胞内送達を促進するわずかな能力によるものである可能性があります 11。 テストしたペプチドの中で、A5Kは生存率に実質的な影響を与えることなく効率的なT細胞編集をもたらし（図1cおよび補足図3）、処理の2日後にアッセイした場合、エレクトロポレーションと比較して有意に高い生存率をもたらしました。 PERC製剤の粒子サイズ分析により、Cas9 RNP単独の粒子よりも大きい直径約60 nmの粒子が明らかになりました（直径約20 nmが観察され、結晶化酵素の直径約15 nmに似ています19）（補足図4）。

我々は、A5K 駆動型 PERC とさまざまな市販の Cas9 試薬との適合性を評価しました。 この研究で使用した非商用のNLS-rich Cas9（参考文献11）および別のNLS-richコンストラクト20に加えて、Invitrogen、Integrated DNA Technologies（IDT）、およびSynthegoから入手したCas9タンパク質はすべてPERCと互換性がありました（補足図11）。 5)。 全体として、これらの結果は、PERC が、3 つの容易に入手可能な試薬 (組換えタンパク質、合成 RNA、および合成ペプチド) のみを必要とし、ゲノム編集の調製または適用に専用のハードウェアを必要としない、T 細胞ゲノム編集のための便利で効率的かつ毒性が最小限に抑えられた方法であることを確立しています。 3成分配合。

次に、追加のヒト細胞タイプで PERC をテストしました。 PERC は、初代ヒト B 細胞 (補足図 6 および 7) および NK 細胞 (補足図 6 および 8) のゲノム編集を促進しました。 B細胞におけるCas9 CD45-RNPを用いたPERCの後、エレクトロポレーションによる92%と比較して、CD45表面発現の67%のノックアウトが観察されました。 PERC後のB細胞の生存率は、未処理またはDMSO処理した細胞の生存率と同様でした（補足図6a）。 NK 細胞の PERC もこれらの条件下で有効であり、エレクトロポレーションでは 52% であったのに対し、17% の CD45 ノックアウトが得られました。 PERCはエレクトロポレーションよりもNK細胞に対する毒性が実質的に低いため、編集された細胞収量は両方の送達方法で同様でした（補足図6b）。

塩基編集は、ゲノム二本鎖切断や相同性修復テンプレート (HDRT) の同時送達を必要とせずに、遺伝子をノックアウトしたり、病原性一塩基多型を修正したりするための魅力的な戦略です。 我々は、アデニン塩基エディター (ABE) RNP を初代ヒト T 細胞に送達する PERC の能力を調査しました。 最近報告されたように 21、HIV 治療薬の臨床標的である HIV 共受容体である CCR5 の発現は、開始コドンを無効にする A-to-G 編集によって無効にすることができます。 進化した TadA-8e デアミナーゼ 23 と、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）5 '-NG-3'24 を認識するように操作された化膿連鎖球菌 Cas9 を組み込んだ構築物を使用して（補足図 9）、ABE CCR5-RNP を CD4 + T 細胞に送達しました。 PERCまたはエレクトロポレーションを使用し、NGSによって9日後の編集頻度を評価しました（補足図10〜12）。 PERC を使用した ABE RNP の単回投与では、エレクトロポレーションでは 73% であったのに対し、23% の編集が達成されました。 編集が改善できるかどうかをテストするために、2 回または 3 回の連続した PERC 処理を実行し、最終的に 35% の編集効率に到達しました。 これらの発見により、PERC は、特に先天性免疫異常に対して臨床関連性を持つ可能性のある効率を備えた塩基編集の簡単な手段として確立されています 25,26。

次に、PERCが初代ヒトT細胞にノックインを行うための非ウイルスDNA HDRTの同時送達を促進できるかどうかをテストしました（補足図13および14）。 前述のように 16,27 、核局在化を促進する切断型 Cas9 標的配列を含むハイブリッド一本/二本鎖 DNA HDRT を使用して、CD5 N 末端に FLAG タグを導入できます。 PERC またはエレクトロポレーションを介した CD5-Cas9 RNP および FLAG タグ HDRT の 200 × 103 T 細胞への送達の 5 日後、PERC が T 細胞の 3% で FLAG タグシグナルを引き起こすことを観察しました (2.7 × 103 CD5- FLAG-tag+ T 細胞）、エレクトロポレーションでは 39% と比較して（22 × 103 FLAG-tag+ 細胞が得られました）。 HDRT DNAの存在下ではペプチドによるCD5ノックアウト効率が76%から14%に低下したため、HDRT DNAは生産的なペプチド-RNP粒子の形成と送達を妨害する可能性があると考えられます。 効率は比較的低いにもかかわらず、ペプチドを利用した RNP と DNA のタンデム送達により、ウイルス ベクターやエレクトロポレーションを使用せずに正確なノックインが容易になります。

T 細胞工学の臨床的に適切なノックイン効率を達成するために、我々は、Cas9 または Cas12a (市販の人工アシダミノコッカス種構築物 28) のいずれかを使用する PERC と、アデノ随伴ウイルス (AAV) を介した 1928z キメラ抗原受容体の送達 ( CAR) T 細胞の TRAC 遺伝子座を標的としたノックイン用 HDRT (図 1d)。 非ターゲティングレトロウイルスベクターと比較して、TRAC 遺伝子座での正確なノックインにより、CAR-T 細胞の抗腫瘍効力が向上することが実証されています 2,29。 処理の6日後、編集細胞の頻度はPERCよりもエレクトロポレーションの方が若干高いことが観察されました（図1d、下）が、エレクトロポレーションの毒性により生細胞の総数が劇的に減少しました（図1d、中央）。および編集された細胞収量（図1d、上）。 したがって、Cas9またはCas12aを使用したPERCにより、エレクトロポレーションと比較してそれぞれ1.4倍または2倍高いCAR-T細胞収量が得られることが観察されました。 注目すべきことに、Cas9 を使用して開発された同じ PERC プロトコルにより、酵素固有の最適化を必要とせずに Cas12a 送達も可能になりました。 これらの結果は、PERC と AAV HDRT の組み合わせが、正確に操作された CAR-T 細胞を作製するための効率的で直接的かつハードウェアに依存しない戦略であることを示しています。

T細胞の生存率はエレクトロポレーション後よりもPERC後の方が高かったため、T細胞トランスクリプトームに対するこれら2つの方法の影響を特徴づけようとしました（図2および補足図15）。 AAVS1 セーフハーバー遺伝子座を標的とした Cas9 RNP の送達後 6 時間、1 日、7 日後に T 細胞からメッセンジャー RNA (NanoString nCounter CAR-T 特性パネル、770 遺伝子) を測定しました。 AAVS1 部位は、編集された細胞の細胞経路への影響を最小限に抑えるために標的とされました 30。 次の条件のペアについて結果を分析しました。RNP のエレクトロポレーションと無治療。 PERC と無治療の比較。 RNPを使用したPERCとDMSO（ペプチドストック内の溶媒）の比較。 RNP を含む DMSO と無治療の比較。 我々は、RNP のエレクトロポレーションと比較して、PERC が誘導する遺伝子発現の変化がはるかに少ないことを発見しました。 未処理と比較して発現の変化が 1.5 倍以上であるという閾値を使用すると、PERC による 7 遺伝子と比較して、28 遺伝子がエレクトロポレーションによって有意な影響を受けました。 PERC の影響は、RNP とペプチド媒介編集で使用される等量の DMSO (0.1% v/v) で処理した細胞の影響と同様でした。 したがって、RNPによるペプチドの穏やかな効果は、ペプチド自体ではなく主にDMSO溶媒（および/または主に細胞外RNPの存在）によるものと思われます（図2aおよび補足図15）。 さらに、NanoString遺伝子カテゴリのアノテーションの分析により、エレクトロポレーションは活性化、消耗、細胞表現型、毒性にわたる役割を持つ遺伝子の発現を大きく変えるのに対し、PERCではこれらの効果は減少するか消失することが示されました（図2b、cおよび補足図15c）。 。 A5K はインフルエンザペプチド赤血球凝集素に由来するため、PBMC 培養中の T 細胞がこのペプチド配列を認識するかどうかをテストしました。 ペプチド誘導性 T 細胞活性化のアッセイでは、A5K 特異的応答は検出されませんでした。 対照的に、H1N1 由来ペプチドのライブラリーは、統計的に有意ではないものの、穏やかな反応を引き起こしました (補足図 16)。 要約すると、PERC は T 細胞に対する影響を最小限に抑えます。

a、Volcano プロットは、編集後 6 時間、1 日、および 7 日のデータを組み込んだ遺伝子発現倍数の変化と調整された P 値 (Padj) を示しています。 赤は顕著な上方制御を示し、青は重大な下方制御を示します。 このプロットはすべての時点を組み合わせたものであり、時点固有の結果は補足図 15 に示されています。nt、未処理。 b、aの1つまたは複数の条件で有意に差次的に発現された84個の遺伝子のセット。 左: 各時点でのフォールドの変化。 中: 各条件の結果。 アスタリスクは、PERC/DMSO で顕著な影響を受けた 1 つの遺伝子を示します。 右: NanoString 遺伝子カテゴリのアノテーション。 c. b の遺伝子とアノテーションを使用して、遺伝子カテゴリ間でフォールドが変化します。 点は個々の遺伝子を表し、影付きの曲線は倍率変化の分布を表します。

ソースデータ

T 細胞ベースの免疫療法の理想的な製造では、複数のゲノム部位での編集が可能になる必要がありますが、ゲノム編集ヌクレアーゼを使用した同時多重編集では転座の頻度が増加します 31,32 。これは治療用途における懸念の原因です 33。 この問題は、多重塩基編集 34,35 を使用して対処されています。この戦略には、市販の塩基編集タンパク質が不足していることと、ノックインを促進できないため、実際にはいくつかの制限があります。 T 細胞へのヌクレアーゼの連続送達を実行すると、転座の頻度が減少します 32 が、CRISPR RNP 送達のエレクトロポレーションの繰り返しに伴う非実用性と細胞死のため、この手法は広く採用されていません。 PERC に関連する限られた表現型への影響と高い生存率に基づいて、我々は反復投与の能力を調査しました。

PERCがT細胞の多重編集を促進できるかどうかをテストするために、Cas9 RNP（図3a、bおよび補足図17）またはCas9 RNPとCas12a RNPの組み合わせ（図3c、図3c、補足図17）を使用して連続または同時ダブルノックインを実施しました。 dおよび補足図18）。 最初のケースでは、2 つのトランスジェニック抗原受容体を共発現する例として、NY-ESO-1 TCR が TRAC をターゲットにし、1928z CAR が B2M をターゲットにしました。 TRAC と B2M をノックアウトする目的は、それぞれ移植片対宿主反応および宿主対移植片反応を改善することです 36。 2 番目のケースでは、CAR は TRAC をターゲットにし、ヒト HLA-E 抗原は B2M をターゲットにしました (B2M への N 末端融合として)。 強制 HLA-E 発現の目的は、宿主 NK 細胞の「自己喪失」応答を防ぐことです 37。 Cas9と併用すると、PERCが連続的または同時に同様の収量のダブルノックインT細胞を生成し、エレクトロポレーションを介した編集と同様であることが観察されました（図3a、b）。 Cas9 酵素と Cas12a 酵素を組み合わせた場合（転座を減少させる別のアプローチ 32）、PERC は同時ダブルノックインを実行した場合のエレクトロポレーションに匹敵する編集細胞収量をもたらし（図 3c、d）、エレクトロポレーションよりも実質的に高いダブルノックイン細胞収量をもたらしました。 2 つの異なるヌクレアーゼを使用した一連の編集後 (図 3d)。

a〜d、Cas9を使用したCD8+ T細胞における逐次（Seq.）および同時（Sim.）ダブルノックイン編集の概略図（a）およびデータ（b）。 Cas9およびCas12aを使用したCD3+ T細胞における連続および同時ダブルノックイン編集の概略図(c)およびデータ(d)。 プロットは両方のノックインを受けた細胞を示しています。 最初の編集から 6 日後にフローサイトメトリーを実施しました。 ｅ、ａおよびｂの実験に対応する、連続的または同時に、１つまたは２つのＲＮＰで処理した場合のｄｄＰＣＲによる転座頻度の分析。 各実験では、異なるヒトドナーからの n = 2 ～ 3 の生物学的複製が行われます。 棒は平均を表します。 エラーバーは標準誤差を表し、P 値は両側ウェルチの対応のない t 検定からのものです。 nt、未処理。

ソースデータ

ドロップレットデジタルPCR（ddPCR）を使用してTRACおよびB2M遺伝子座の多重編集後の平衡転座または二動原体転座の頻度を定量しました。 どちらのタイプの転座でも、同時編集では逐次編集よりも多くの転座が発生しましたが、PERCを2回連続して適用した後は検出可能な転座はありませんでした（図3e）。 エレクトロポレーションによる逐次送達は細胞数の大幅な減少を引き起こすため（補足図17cおよび18c）、標的ヌクレアーゼのペアを使用する場合、転座を最小限に抑えるための実用的な戦略ではありません。 対照的に、逐次 PERC は細胞生存率への悪影響が少ないため、複数の標的ヌクレアーゼを使用する場合に転座頻度を最小限に抑えるための戦略となります。 別の実験では、アンプリコンベースの NGS を使用して、オフターゲット編集について 2 つの遺伝子座、EMX1 および HEKsite4 をターゲットとする RNP を評価しました。 これらの部位が使用されたのは、他のガイド RNA にはオフターゲット部位がなく、この分析には非実用的であるために選択されたためです。 編集頻度は両方のオフターゲットサイトで低く（EMX1では1％以下、HEKsite4では4％以下）、オフターゲットとオンターゲットの編集率はPERCとエレクトロポレーション間で同様でした（補足図19）。 全体として、PERC は、遺伝毒性のリスクが少ない多重編集細胞の製造に採用できる、信頼性が高く収量の高い逐次編集を容易にします。

逐次RNP送達がより複雑な編集を促進できるかどうかをテストするために、PERCを使用して、初代ヒトT細胞の臨床的に関連するTRAC、B2M、およびCD5（参考文献38）遺伝子の単一、二重、または三重のノックアウトを作成しました（図4a〜cおよび図4a〜c）補足図20〜22）。 CAR AAV HDRTの添加あり（図4b）またはなし（図4c）のいずれかでPERC媒介TRACノックアウトを実行し、同様のエレクトロポレーション編集を実施しました。 PERC はエレクトロポレーションと比較して編集細胞収量を向上させました。シングルノックアウト (TCR-) では 3 倍、ダブルノックアウト (TCR- B2M-) では 8.5 倍、トリプルノックアウト (TCR- B2M- CD5-) では 14 倍高くなりました。 T細胞（図4c）。 この傾向は、AAV処理細胞でも明らかであり（図4b）、シリアルPERCが、エレクトロポレーションを使用しない場合は非実用的であった、複雑で転座のない細胞治療製品の製造の改善を支援できることを再度示唆しました。

a、CD3+ T細胞の3つの遺伝子座の連続編集の概略図。 b、TCR、CAR、B2M、およびCD5の表面発現についてフローサイトメトリーで測定した、PERCを使用した編集とエレクトロポレーションを使用した編集の比較。 報告されているCAR+細胞はTCR-でもあります。 c、CAR AAV を使用しない編集。 各条件の細胞数は、4 × 106 T 細胞の初期入力に合わせて調整されます。 n = 3 つの異なるヒトドナーからの生物学的複製。 棒は平均を表します。 エラーバーは標準誤差を表し、P 値は両側ウェルチの対応のない t 検定からのものです。 d、CD62LおよびCD45RA表面発現についてフローサイトメトリーによって測定した、送達方法間のCD4+およびCD8+細胞表現型の比較(編集結果とは無関係)。 円グラフのセグメントは、各表現型の平均割合を表します。 点線は、二元配置分散分析およびホルム・シダック多重比較検定からの P 値との比較を示します（補足図 24 および 25 は比較を示します）。 e. セル製造の改善を評価するための指標の説明。 f、逐次編集の概略図。 g, 編集に使用されたセルの数に対する、編集されたセルの時間の経過に伴う拡大。 n = 3 つの異なるヒトドナーからの生物学的複製、別々にプロット。

ソースデータ

養子細胞療法による臨床転帰は、細胞投与量だけでなく、改変 T 細胞産物の細胞表現型にも影響を受ける可能性があります 39。 PERC を 3 ラウンド行った後、ターミナルエフェクター表現型 (CD62Llo CD45RAhi) を持つ T 細胞の割合は、未処理の細胞の割合と同様でした。 対照的に、3回エレクトロポレーションされた少数の生き残った細胞は、それほど強力ではない抗腫瘍活性と関連するこの表現型の増加を示しました（図4dおよび補足図23〜26）。 単一送達とトリプル送達の比較は、エレクトロポレーションがナイーブ様表現型（CD62Lhi CD45RAhi）の減少につながるのに対し、PERC は安定した割合を維持することを示しました。これは、CAR-T 細胞の治療応用にとって重要です 2,41（補足図 24）。 ）。

製造プロセスから臨床移植までの期間を通じて編集された細胞収量の重要性を考慮して（図4e）、延長培養で連続的に編集された細胞を追跡しました（図4f）。 TRAC 遺伝子座での CAR ノックインのために Cas12a RNP と AAV を送達し、その 2 日後に B2M をノックアウトするために Cas9 RNP を送達しました。 細胞を14日間培養し、PERCまたはエレクトロポレーションから生じるCAR+ B2M-細胞収量を経時的に測定しました（図4gおよび補足図27）。 全体として、ペプチド処理細胞はエレクトロポレーション細胞よりもよく生存し、増殖したため、試験した 3 人のドナーで同等またはそれ以上の編集細胞収量が得られました。

（エレクトロポレーションと比較して）PERCに関連する細胞収量の向上と表現型への影響の減少を確立したので、次にPERC CAR-T細胞の細胞毒性をテストしました。 gRV形質導入、エレクトロポレーションCas12a TRAC-RNPとAAV HDRT、またはCas12a TRAC-RNPとAAV HDRTを使用したPERCのいずれかを使用して、1928z CARを発現するようにバルクT細胞を操作しました（図5aおよび補足図28）。 CAR+ T 細胞の割合は、3 つのエンジニアリング戦略全体で同様でした (図 5b)。 CD19+ A549 標的細胞との共培養による反復刺激の有無による条件を比較しました。 反復刺激により、各戦略を使用して生成された細胞のナイーブ表現型が減少し、ターミナルエフェクター表現型が増加しました（補足図28b）。 次に、各条件の細胞をルシフェラーゼ発現 NALM6 急性リンパ芽球性白血病細胞と 1 日間共培養し、細胞毒性を定量しました。 反復刺激後、いずれかの方法で生成されたTRAC-CAR-T細胞はgRV条件を上回り（図5c、d）、PERC CAR-T細胞がCARをTRAC遺伝子座に標的化する利点を再現することを示しています2。

a、反復刺激（rep-stim）および細胞毒性アッセイの概略図。 gRV、Cas12a RNP エレクトロポレーションと AAV、または Cas12a RNP PERC と AAV のいずれかを使用して CAR を発現するように CD3+ T 細胞を編集しました。 b、CD19+ A549細胞を使用した反復刺激ありまたはなしの各条件におけるCAR+細胞のパーセンテージ。 c、d、各条件におけるT細胞のNALM6細胞毒性アッセイ（c）、および曲線下面積分析（d）。 n = 3 つの異なるヒトドナーからの生物学的複製。 棒は平均を表します。 エラーバーは標準誤差 (生物学的反復 3 × 技術的反復 3) を表します。 P 値は、両側ウェルチの対応のない t 検定から得られます。 e、1グループあたりn = 8匹のマウスを使用した、インビボ腫瘍チャレンジ実験の概略図。 f、NALM6細胞毒性アッセイ。 エラーバーは、3 つの技術的反復からの標準誤差を表します。 g、CAR-T細胞を注入したマウスがすべて生存していた最後の測定日のBLI値。 P 値は、両側ウェルチの対応のない t 検定から得られます。 h、カプラン・マイヤー生存分析。 P 値はログランク検定からのものです。 編集された条件と未処理 (nt) 細胞の各比較の P < 0.001。 i. 評価されたさまざまな配信方法をまとめた表。

ソースデータ

多重編集された細胞の in vivo 抗腫瘍効力を評価するために、PERCまたはエレクトロポレーションのいずれかを使用して逐次TRAC-CAR B2M-KO編集を実施しました（図5eおよび補足図29）。 十分な数の細胞を生成するために、以前の実験で使用した PERC プロトコルを、同様の編集効率、生存率、編集された細胞収量で 100 μl 培養物から 9 ml にスケールアップしました。 in vitro 細胞毒性アッセイでは、T 細胞は 2 つの送達方法間で同様に機能しました (図 5f)。 我々は、CAR-T細胞の用量を低下させて、さまざまなCAR-T細胞集団の機能限界を明らかにするin vivo「ストレステスト」を実施した。 各方法を使用して生成された合計 4 × 105 個または 2 × 105 個の CAR+ T 細胞（B2M ノックアウトの効率に関係なく、このモデルシステムの効力に影響を与えるとは予想されない）を、5 × 105 個の NALM6 を移植した NSG マウスに静脈内注射しました。 4日前の細胞。 腫瘍量は、生物発光イメージング（BLI）によって経時的に評価されました（補足図30）。 21日目（CAR-T細胞を注射したマウスがすべて生存していた最後の時点）の評価では、各CAR-T細胞用量内で各方法で同様の腫瘍量が示されました（図5g）。 PERC とエレクトロポレーションも、実験期間を通じて各用量内で同様の生存率をもたらしました (図 5h)。 総合すると、これらの結果は、この前臨床モデルにおいて、PERC CAR-T 細胞がエレクトロポレーション対応物と同様の治療効力を有することを示しています。

私たちの発見は、初代ヒトT細胞から生成される高度な細胞療法製品を安価で容易かつ効率的に生産するためのエレクトロポレーションに代わる魅力的なPERCとしてのPERCを確立しています。 PERC は、ABE だけでなく Cas9 および Cas12a ヌクレアーゼに対しても良好に機能し、CRISPR エフェクターとの広範な互換性を示唆しています。 PERC は、臨床関連遺伝子のノックアウト、ノックイン、および/または治療塩基編集の連続的な組み合わせを特徴とする、自家および同種異系 (「既製」) 製品の生体外製造の新たな可能性を切り開きます。 エレクトロポレーションと比較して、PERC にはいくつかの利点があります。細胞のトランスクリプトームと表現型の混乱が最小限に抑えられること、同時編集による遺伝毒性を回避するための逐次送達との互換性、専用ハードウェアからの独立性です。 PERCは、ウイルス形質導入と同じくらい簡単に実装でき、同時に複数の遺伝子座の正確なゲノム編集を可能にします（図5i）。 さらに、PERC は、エレクトロポレーションを使用して達成される細胞収量を超える編集された細胞収量を生成します。 編集された細胞収量は、細胞治療製品を生成する際の編集効率と比較してより重要な指標です。 それでも、注意深くガイド RNA を選択すれば、CRISPR 酵素のエレクトロポレーションによって達成される編集効率に近づく編集効率を PERC によって達成することは確かに可能です。

PERC は (エレクトロポレーションと比較して) 細胞の取り扱い手順を最小限に抑え、完全に自動化された細胞処理パイプラインに組み込むことができます。 中所得地域はウイルス導入に対応した治療用細胞製造ハードウェアを利用できるかもしれないが、エレクトロポレーションベースの編集プロトコルで必須とされるクリーンルームなどのインフラストラクチャーが決定的に不足している42。 PERC は細胞の取り扱い手順を最小限に抑え、広く利用可能な自動細胞製造ハードウェアと互換性があり、ポイントオブケア製造に組み込むことができるため、これがなければ実用的ではない臨床応用が可能になります。

次世代免疫療法用途への CRISPR 媒介エンジニアリングの広範な採用を加速するだけでなく、PERC を塩基編集酵素とともに適用して、病原性変異を修正することで先天性免疫異常を治療することも可能です 43。 PERC に必要なのは、簡単に入手できる化学的に定義された試薬 3 つだけ (さらに効率的なノックインのための AAV) だけであるため、実験室研究、工業生産、臨床パイプラインにとって実用的なツールとなり得ます。 PERC の採用により、コストが削減され、遺伝毒性が最小限に抑えられ、正確に操作された治療用リンパ球へのアクセスが拡大され（ポイントオブケア生産の状況を含む）、さらなる開発により in vivo ゲノム編集が促進される可能性があります。

匿名の健康なヒトドナーからの初代成人血液細胞を、STEMCELL Technologies から白血球除去パックとして購入しました。 特定のリンパ球は、製造元提供の説明書に従って、ヒト CD4+ T 細胞、CD8+ T 細胞、CD3+ T 細胞、B 細胞または NK 細胞用の EasySep 分離キット (STEMCELL) を使用した磁気ネガティブ選択によって分離されました。 T細胞は使用するまで液体窒素中で保存した。 B細胞とNK細胞は新鮮なものを使用しました。

単離したT細胞を解凍し(出産から-3日目)、5%ウシ胎児血清(FBS)、50μM 2-メルカプトエタノールおよび10mM N-アセチル-1を補充したX-VIVO 15培地(Lonza)中で一晩培養した。 -システイン。 細胞を活性化し（分娩から-2日目）、抗ヒトCD3/CD28磁性Dynabeads（Gibco 40203D）を添加したX-VIVO 15培地中で1×106細胞ml-1で2日間、ビーズごとに培養した。 -細胞比 1:1、200 U ml-1 IL-2 (プロロイキン)、5 ng ml-1 IL-7 (R&D Systems)、および 5 ng ml-1 IL-15 (R&D Systems)。 2 日間の活性化後、EasySep 細胞分離磁石 (STEMCELL) を使用して Dynabeads を細胞培養物から取り出しました。 ゲノム編集のために、ウェルあたり 200 × 103 T 細胞を 100 μl Opti-MEM (Gibco) に懸濁しました (処理の詳細は以下に示します)。 1時間の処理後、FBSを添加したX-VIVO-15回復培地（またはAAV処理を含む実験では、FBSを含まない培地）を細胞に添加した。 特に指定のない限り、ゲノム編集後（後述）、細胞を 300 U ml-1 IL-2（プロロイキン）を添加した 0.5 × 106 細胞 ml-1 の X-VIVO 15 で培養し、2 ～ 3 日ごとに分割しました。

単離した B 細胞を活性化し、10% FBS、50 μM 2-メルカプトエタノール、100 ng ml-1 MEGACD40L (Enzo)、200 を添加した Iscove 改変ダルベッコ培地 (Thermo Fisher) 中で 1 × 106 細胞 ml-1 で 2 日間培養しました。 ng ml-1 抗ヒト RP105 (BioL​​egend)、500 U ml-1 IL-2 (プロロイキン)、50 ng ml-1 IL-10 (Thermo Fisher)、および 10 ng ml-1 IL-15 (R&D Systems)。 ゲノム編集のために、ウェルあたり 200 × 103 個の B 細胞を、Opti-MEM (Gibco) と最大 20% のペプチド:RNP 製剤の混合物からなる 100 μl に懸濁しました (処理は以下に詳述します)。 1 時間の処理後、回復培地を添加して細胞を元の培養条件に戻しました。 処理後、B 細胞を 0.5 × 106 細胞 ml-1 で培養し、2 ～ 3 日ごとに分割しました。

分離したNK細胞を、5% FBS、50μM 2-メルカプトエタノール、10 mM N-アセチル-1-システインを添加したX-VIVO 15培地（Lonza）および1,000 U mlで1×106細胞ml-1で6日間培養しました。 -1 IL-2 (プロロイキン)、抗ヒト CD335 (NKp46) および抗ヒト CD2 抗体 (Miltenyi Biotec) があらかじめロードされた MACSiBead 粒子で活性化されています。 6 日間の活性化後、EasySep 細胞分離磁石 (STEMCELL) を使用して MACSiBead 粒子を細胞培養物から除去しました。 ゲノム編集のために、ウェルあたり 200 × 103 個の NK 細胞を、Opti-MEM (Gibco) と最大 20% のペプチド:RNP 製剤の混合物からなる 100 μl に懸濁しました (処理は以下に詳述します)。 1 時間の処理後、FBS を添加した X-VIVO-15 回復培地を細胞に添加しました。 ゲノム編集後、NK 細胞を 1,000 U ml-1 IL-2 を含む 0.5 × 106 細胞 ml-1 で培養し、5 日目に分割しました。

細胞生存率は、製造業者が提供する説明書に従ってCellTiter-Gloアッセイ(Promega G7570)を使用して評価した。 発光は、Spark プレートリーダーを使用して測定しました。

TAT ペプチドは GenScript (GSCRPT-RP20256) から購入し、他のペプチドはカスタム固相合成 (CPC Scientific; 純度 95%) 経由で入手しました。 すべてのペプチドは凍結乾燥するか、DMSO 中の 10 mM ストックとして -20 °C でデシケーター内に保存されました。 ペプチド配列を図1および補足表1に示します。

すべての実験で使用される化膿連鎖球菌 Cas9 タンパク質（補足図 5 に示すものを除く）には、6 つの SV40 核局在化配列（Cas9-6 × NLS）があります。 4 つは N 末端、2 つは C 末端です11 (Addgene ID# 88917; Staahl et al., 2017 では「4 × NLS-Cas9-2 × NLS」と呼ばれています)。 システインを含まない Cas9-6 × NLS コンストラクト (Addgene ID# 194246; C80S / C574S) も機能的に同等であるため、区別せずに使用しました。 Cas9-6 × NLS を大腸菌で発現させ、前述のようにニッケル アフィニティー クロマトグラフィー (リポ多糖を除去する洗剤洗浄を使用)、ヘパリン アフィニティー クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製しました 18。 精製タンパク質を、25 mM リン酸ナトリウム pH 7.25、300 mM NaCl、および 200 mM トレハロースの緩衝液中で約 50 μM まで濃縮し、-80 °C で保存しました。 タンパク質の発現と精製は、UC Berkeley MacroLab によって実行されました。 Cas9-triNLS (Addgene ID# 196245; 最初に報告されたとき 20 は 3 × NLS-Cas9 と呼ばれました) は、同じプロトコールを使用して RCW 研究室によって発現および精製されました。 Alt-R As Cas12a Ultra (10001273)、Alt-R Sp Cas9 Nuclease V3 (1081058)、および Alt-R Sp HiFi Cas9 Nuclease V3 (1081061) は IDT から購入しました。 SpCas9 2NLS ヌクレアーゼは Synthego から購入しました。 Invitrogen TrueCut Cas9 Protein v2 (A36498) は Thermo Fisher から購入しました。

化膿連鎖球菌 Cas9 シングルガイド RNA (sgRNA) は、メーカー推奨の標準化学修飾を施した Synthego から購入し、水に再懸濁するか、IDT(Alt-R) から購入し、IDT 二本鎖緩衝液またはピロ炭酸ジエチル (DEPC) 処理水に再懸濁しました。 使用前に、sgRNA を 20 mM HEPES pH 7.5 および 150 mM NaCl で 15 μM に希釈し、95 °C に 5 分間温め、25 分間室温までゆっくり冷却することによってリフォールディングしました。 スペーサー配列は補足表 2 にリストされています。

ペプチド媒介送達実験では、Cas9 タンパク質を「RNP 緩衝液」(20 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、10% グリセロールおよび 2 mM MgCl2) で 10 μM に希釈しました。 sgRNA を 20 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、10% グリセロールおよび 2 mM MgCl2 で 15 μM に希釈しました。 特に指定しない限り、Cas9:sgRNAのモル比は1:1.5であった。 Cas9 を等量の sgRNA と混合して 5 μM の RNP 複合体を生成しました。RNP 濃度は Cas9 タンパク質の量によって定義されます。 非ウイルスノックイン実験では、Cas9 を RNP バッファーで 20 μM に希釈し、等量の 30 μM の sgRNA と混合して、最終濃度 10 μM RNP を得ました。 エレクトロポレーションでは、Cas9 を RNP バッファーで 40 μM に希釈し、sgRNA を IDT 二重バッファー (30 mM HEPES pH 7.5 および 100 mM 酢酸カリウム) または DEPC 処理水で 60 μM に希釈しました。 Cas9 を等量の sgRNA と混合し、20 μM の RNP 複合体を生成しました。

Cas9 RNP および RNP:ペプチド製剤の代表的なサンプルを、石英低容量キュベット (ZEN2112) を備えた Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical) 機器を使用して評価しました。 Cas9 ベースの編集実験で使用される典型的な条件のおよそ 3 倍のスケールアップとして、27 μl の B2M-Cas9 RNP を RNP バッファー中で 5 μM (135 pmol) で調製し、粒子サイズを室温で測定しました。 次いで、２７μｌのＲＮＰサンプルに、１０％ＤＭＳＯストック中の１ｍＭの３μｌのＡ５Ｋペプチドを補充した。この混合ステップは、編集実験で使用したものと同様である（ＲＮＰ形成後、細胞へのＲＮＰ：ペプチドの添加前）。 得られた３０μｌのＲＮＰ：ペプチド配合物は、４．５μＭのＣａｓ９ ＲＮＰ（１３５ｐｍｏｌ）および１ｍＭのＡ５Ｋペプチド（３ｎｍｏｌ）を含んでいた。 この配合物を室温で 1 分間インキュベートし、RNP のみの溶液に使用したものと同じ設定を使用して粒子サイズを測定しました。 データは、Zetasizer 分析ソフトウェアを使用して「数値によって」分析されました。

ペプチド (100% DMSO 中の 10 mM) を DEPC 処理水で 1 mM に希釈し (90% 水と 10% DMSO の溶液が得られます)、RNP に添加すると、最終的な体積の 20% 以下になりました。最終容量（たとえば、Opti-MEM 内の 100 μl 細胞を含むウェルの配合量は 20 μl 以下）。 RNP/ペプチド混合物を96ウェル丸底プレートに加え、ウェルあたり100μlのOpti-MEM（Gibco）中の200×103細胞をRNP/ペプチド混合物に加えた。 特に明記しない限り、細胞処理中のRNPの最終用量はウェルあたり50pmolで、最終ペプチド濃度は10μMでした。 ペプチドを利用した送達のすべてのケースにおいて、DMSO の最終濃度はペプチド濃度に比例しました: 10 μM ペプチドあたり 0.1% DMSO。 この濃度の DMSO を「模擬」ネガティブ コントロール条件に使用しました。 AAVを含まない実験では、37℃で1時間インキュベートした後、100μlの処理量を2枚のプレートに半分に分割し、その後、1ウェルあたり150μlの培地を加え、希釈はしましたが、処理は除去しませんでした。 AAV を含む実験では、編集後、100 µl Opti-MEM 中の 200 × 103 細胞を遠心分離し、上清を廃棄し、100 µl の無血清培地で細胞を回収し、その後 AAV を添加しました。 一晩インキュベートした後、培地を新鮮な血清含有培地と交換し、編集の2日後に細胞を分割し始めた。 回復培地中の添加剤および刺激カクテルの濃度は、最終濃度が各細胞型についての上記の説明と一致するようなものであった。

4D nucleofector (Lonza) で、EH-115 パルスを使用して、50 pmol の Cas9、Cas12a、または ABE RNP を、20 μl の P3 バッファーおよびサプリメント (Lonza V4XP-3032) に再懸濁した 200 × 103 T、B、または NK 細胞にエレクトロポレーションしました。コード。 細胞を37℃で10分間インキュベートし、その後、上記のようにさらなる細胞培養のために希釈する前に、80μlの予熱した培地でレスキューした。 AAV ノックイン実験では、60 pmol の RNP をウェルあたり 0.5 × 106 個または 1 × 106 個の T 細胞にエレクトロポレーションしました。

組換え AAV6 ベクターを使用して、ノックインを作成するための HDRT を送達しました。 (1) SpCas9 互換の TRAC 標的 CAR AAV には、TRAC エクソン 1 の開始付近を標的とする相同アームが含まれています。カーゴは P2A、1928z CAR、P2A です。 この編集戦略では、ノックイン後、CAR は内因性 TCRα をコードする mRNA と共シストロニックに転写されますが、別のタンパク質として翻訳され、TCR は表面発現されません 2。 CAR には、CD8A シグナル配列、SJ25C1 scFv、CD28 ヒンジ、CD28 膜貫通ドメイン、CD28 共刺激ドメイン、および CD3ζ シグナル伝達ドメインが含まれています。 (2) SpCas9 互換の TRAC 標的 NY-ESO-1 TCR AAV には、TRAC エクソン 1 の開始付近を標的とする相同アームが含まれています。カーゴは P2A、TCRβ 鎖、P2A、および TCRα 鎖の一部です。 NY-ESO-1 TCRα の C 末端部分は、内在性 TRAC エクソンによってコードされています。 (3) SpCas9 互換 B2M 標的 CAR AAV には、B2M エクソン 1 の開始付近を標的とする相同アームが含まれています。カーゴは 1928z CAR、終止コドン、および bGH ポリ A テールです。 (4) Cas12a 互換 TRAC 標的 CAR AAV には、TRAC エクソン 1 を標的とする相同アームが含まれています。この部位は SpCas9 互換 CAR が標的とする部位とは異なりますが、カーゴは同じです。 (5) Cas12a 互換 B2M 標的ペプチド -B2M-HLA-E AAV には、B2M エクソン 2 を標的とするための相同アームが含まれています。カーゴは、P2A、シグナル配列、HLA-G ペプチド (HLA-E 上に提示される)、リンカーです。 、B2Mレスキュー、リンカー、HLA-E、終止コドンおよびbGHポリAテール。 ノックイン後、発現される B2M は HLA-E37 との融合体です。

初代ヒト PBMC は STEMCELL Technologies の白血球除去パックから単離され、使用するまで液体窒素中で保存されました。 細胞を解凍し、96ウェルTCプレートのウェルあたり100μl培地中1×106細胞の濃度で、非必須アミノ酸、l-グルタミンおよび5％ヒトAB血清を補充したRPMI-1640中で培養した。 A5K ペプチド、インフルエンザ A (H1N1) HA タンパク質 PepTivator プール (Miltenyi Biotec)、または SARS-CoV-2 スパイクタンパク質 PepTivator プール (Miltenyi Biotec) をそれぞれ DMSO で希釈し、最終濃度 1 μg ペプチド ml- で PBMC 培養物に添加しました。 1 または別途示されるとおり。 最終濃度５０ｎｇ ｍｌ －１ のホルボール１２－ミリスチン酸１３－アセテート（ＰＭＡ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ）と最終濃度１μＭのイオノマイシン（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）をポジティブコントロールとしてＰＢＭＣに添加した。 2 時間のインキュベーション後、ブレフェルディン A (BD Biosciences) を 1 μg ml-1 で添加しました。 8 時間のインキュベーション後、細胞を T 細胞表面マーカー (CD3、CD4、および CD8) について染色し、メーカー提供のプロトコールに従って Cytofix/Cytoperm キット (BD Biosciences) を使用して固定および透過処理し、細胞内 TNF および IFN- γ、フローサイトメトリーによって分析されました。

CD3+ T細胞は上記のように調製され、送達と比較して-2日目に活性化された。 0日目に、TRAC sgRNA (Cas9:sgRNA比1:1.2)で形成されたRNPを、A5Kペプチドまたはエレクトロポレーションを使用して送達しました。 エレクトロポレーションでは、ウェルあたり 1 × 106 細胞に対して 60 pmol の RNP を送達し、300 U ml-1 IL-2 (プロロイキン) を含む無血清 X-VIVO 15 培地で細胞をレスキューしました。 A5K ペプチド媒介送達の場合、培地 100 μl あたり 2 × 105 細胞に対して 1,500 pmol A5K を使用して 50 pmol の RNP を送達しました (最終ペプチド濃度 15 μM)。 37℃で1時間インキュベートした後、細胞を遠心分離（300g、5分間）によってペレット化し、300 U ml-1 IL-2を含む無血清X-VIVO 15培地に2×106細胞ml-1になるように再懸濁しました。 細胞に 5 × 104 の感染多重度で AAV を導入しました。一晩インキュベートした後、無血清 AAV 含有培地を 300 U ml-1 IL-2 を含む新鮮な X-VIVO 15 培地に交換し、細胞を再懸濁しました。 1 × 106 細胞 ml-1 まで。 CARノックイン条件と並行して、ウイルスを含まないTRACを標的としたRNPを用いて同様の条件を実施した。

2日目に、生細胞の数を推定するためにトリパンブルー染色で細胞を数えた。 TRACノックアウトまたはCARノックイン処理細胞のサブセットを遠心分離（300g、5分間）によって分離およびペレット化し、細胞密度を新鮮培地で1×106細胞ml-1に正規化しました。 残りの細胞をペレット化し、エレクトロポレーションおよびB2Mを標的とするRNPについて上述したA5Kペプチド媒介送達と同じプロトコールを使用して処理した。 処理後、300 U ml-1 IL-2 を補充した X-VIVO 15 培地で細胞をレスキューし、細胞密度を 1 × 106 細胞 ml-1 に調整しました。 4日目に、トリパンブルー染色で細胞を計数し、各処理条件の細胞密度を新鮮な培地で1×106細胞ml-1に調整しました。 二重ノックアウト/CARノックイン処理細胞の別のサブセットを、CD5を標的とするRNPを用いた上記と同様の連続編集の第3ラウンドのために分離した。 細胞を、300 U ml-1 IL-2 を含む補足 X-VIVO 15 培地でレスキューし、細胞密度を 1 × 106 細胞 ml-1 に調整しました。 6日目に、各編集条件をトリパンブルー染色でカウントし、各処理の細胞密度を新鮮な培地で1×106細胞ml-1に調整しました。 各処理の分岐は異なる開始細胞数で開始されたため、各条件 (たとえば、1x、2x、または 3x 編集) の総生細胞数は、理論上の開始条件である 4 × 106 細胞に正規化され、細胞が調整されました。カウントは、2 日ごとに測定された増殖に基づいて外挿されました。 7日目に、フローサイトメトリーを実行して、TCR、B2M、CD5ノックアウトおよびCARノックインの編集効率と細胞数をアッセイしました。 これらの値に基づいて、各条件の A5K ペプチド媒介送達 (またはエレクトロポレーション) について 6 日目の正規化細胞収量を計算しました。 別に、T 細胞の表現型を、CD45RA および CD62L の表面発現を染色することによって検査しました。

CD8+ T 細胞は n = 3 人のドナーから活性化され、Dynabead 除去後 0 日目および/または 2 日目に編集を受けました。 TRAC編集にはCas9 RNPおよびNY-ESO-1 TCR AAVが含まれ、B2M編集にはCas9 RNPおよび1928z CAR AAVが含まれました。 細胞を2日ごとに継代した。 最初の編集から 6 日後にフローサイトメトリーを実施しました。 細胞をペレット化し、QuickExtract DNA 抽出溶液 (Biosearch Technologies #SS000035-D2) に再懸濁し、65 °C で 10 分間、その後 96 °C で 5 分間インキュベートし、ゲノム DNA 抽出まで -20 °C で保存しました。

CD3+ T 細胞は n = 3 人のドナーから活性化され、Dynabead 除去後 0 日目および/または 2 日目に編集を受けました。 TRAC編集にはCas9 RNPおよび1928z CAR AAVが含まれ、B2M編集にはCas12a RNPおよびHLA-E AAVが含まれました。 細胞を2日ごとに継代した。 最初の編集から 6 日後にフローサイトメトリーを実施しました。

ABE8e-SpCas9-NGベースエディタータンパク質（補足図14）は、Aldevronによって発現および精製され、20 mM HEPES-KOH pH 7.5、150 mM NaClおよび10％（v/v）グリセロールのバッファー中に-80°で保存されました。 C. この構築物は、(N 末端から C 末端まで) 二部構成の SV40 NLS、触媒的に死んだ「8e」TadA デアミナーゼ ドメイン 23、触媒的に活性な別の「8e」TadA、「NG」PAM Cas9 の D10A ニッカーゼ バージョンで構成されています (参考文献24)、二部構成のSV40 NLSおよびヌクレオプラスミンNLS。 ABE8e-NG Cas9 RNPは、上記のRNP形成プロトコルに従って「CCR5off-1」sgRNA（補足表2）を用いて形成されました。 次に、200 pmol の RNP を、20 μM A5K ペプチド (100 μL Opti-MEM 中の最終濃度) とともに初代ヒト T 細胞 (上記のプロトコール) に適用しました。 細胞を単回投与で処理し、4日後に2回目の投与で追跡調査するか、さらに3日後に3回目の投与で再度追跡調査しました。 最初の投与から 9 日後 (3 回目の投与から 2 日後) に、ゲノム DNA が抽出され、フローサイトメトリー分析が行われました。 編集効率は、以下に説明するディープ シーケンスによって分析されました。 フローサイトメトリー分析は、CCR5 表面発現のノックアウトと編集された細胞収量を測定するために使用されました。

HDRT は、シグナルペプチドの下流の CD5 の細胞外部分に FLAG タグの N 末端融合物を付加するように設計されました。 テンプレートは、40 nt の左相同性アームと 40 nt の右相同性アーム、および前述の短縮型 Cas9 結合部位を備えた 160 mer の一本鎖 DNA オリゴヌクレオチドとして合成されました 16,27。 処理ウェルごとに、200 pmol の HDRT オリゴ (プライマーと鋳型の比 1:1) を 200 pmol の RNP と混合し、これに 3,000 pmol の A5K を添加しました (100 μl Opti-MEM 中の A5K の最終濃度が 30 μM となるように)。 編集の 5 日後、細胞を CD5 および FLAG タグについて染色し、Attune NXT フローサイトメーターで分析しました。

フローサイトメトリーは、96 ウェルオートサンプラーを備えた Attune NxT フローサイトメーター (Thermo Fisher Scientific) または LSRFortessa X-50 フローサイトメーター (BD Biosciences) で実行されました。 メーカー提供の説明書に従って、細胞をFACS緩衝液（リン酸緩衝食塩水（PBS）、2％FBSおよび1mM EDTA）に再懸濁し、生死染色および表面マーカーターゲティング抗体（補足表3）で染色しました。 細胞数を定量化するために、規定の容量（ウェルあたり 60 μl）でサンプリングしました。 サイトメトリーデータは、FlowJo ソフトウェア (BD Biosciences) を使用して処理および分析されました。

ゲノム編集は、PCR アンプリコンの NGS によって定量化されました。 細胞を300gで5分間遠心分離してペレット化し、PBSで1回洗浄し、ウェルあたり50μlのQuickExtract溶液（Lucigen）に再懸濁し、65℃で10分間、次いで95℃で5分間インキュベートした。 ゲノム DNA は -20 °C で保存されました。 メーカー提供のプロトコールに従って、PrimeSTAR GXL DNA ポリメラーゼ (Takara Bio) または Kapa HiFi (Roche) を使用して PCR 増幅を実行しました。 SPRI ビーズ (UC Berkeley シーケンシング コア) を使用してアンプリコンを精製し、NanoDrop を介して濃度を定量しました。 アンプリコンライブラリーをプールし、Illumina MiSeq で 300 bp ペアエンドリードでサンプルあたり少なくとも 10,000 リードの深さまでシーケンスしました。 編集結果は Cortado (https://github.com/staciawyman/cortado) を使用して分析されました。 簡単に言うと、リードはアダプターでトリミングされ、単一のリードにマージされました。 これらの結合されたリードは、切断部位での編集イベントを特定するために、ターゲット参照配列にアラインメントされました。 インデル頻度は、切断部位と重複する挿入または欠失、または切断部位の両側の 3 bp ウィンドウ内に発生する挿入または欠失を含むリードをカウントすることによって計算しました。 切断部位周囲のウィンドウ内で発生する一塩基多型は、この値にはカウントされませんでした。 インデルリードの総数をアライメントされたリードの総数で割って、% インデルに達しました。 塩基編集実験では、結合されたリードをターゲット参照配列にアライメントして、ターゲット遺伝子座での塩基編集イベントを特定しました。 塩基編集の頻度は、編集を伴うリード数をアラインメントされたリードの合計で割ったものとして計算され、各部位について個別に計算されました。

細胞を300gで5分間遠心分離してペレット化し、ウェルあたり40μlのQuickExtract溶液(Lucigen)に再懸濁し、65℃で10分間、次いで95℃で5分間インキュベートした。 ゲノム DNA は -20 °C で保存されました。 プライマー (補足表 4) および 5' 6-FAM 標識プローブは、IDT (ZEN-3' Iowa Black FQ クエンチャー) によって合成されました。 ddPCR 反応は、プローブ用の ddPCR Supermix (dUTP なし) (Bio-Rad #1863023) を使用して調製し、液滴を生成し、QX200 液滴ジェネレーターおよびリーダーを使用して読み取りました。 データは、Bio-Rad QuantaSoft Analysis Pro ソフトウェアを使用して分析されました。 実験サンプルを対照サンプルと比較し、鋳型 DNA の量が異なる場合はそれに応じてスケールを調整しました。

CD3+ T 細胞を、エレクトロポレーションまたは A5K 送達のいずれかを使用して、0 日目に Cas12a TRAC-RNP および CAR AAV で編集し、2 日目に Cas9 B2M-RNP で編集しました。 編集された細胞と未処理の細胞を 2 週間培養し、2 日ごとに継代しました。

gRV ベクターには、P2A タグで区切られた 1928z CAR と短縮型 LNGFR が含まれています。 ウイルスはRetro-X濃縮装置（タカラバイオ）を用いて濃縮した。 組織培養プレートをレトロネクチン（タカラバイオ；PBS中15μg ml-1、4℃で一晩）で前処理した。 CD3+ T細胞をポリブレン（10μg ml-1）およびウイルスと混合し、プレーティングし、遠心分離（2,000g、1時間、30℃）し、TCインキュベーター内で一晩インキュベートし、新鮮なT細胞培地に再懸濁しました。 続いて、細胞は 2 回目の gRV 形質導入を受けました。

mKate2-NLS+ CD19+ A549 細胞は、FBS (Gibco、10%)、ピルビン酸ナトリウム (Gibco、1%)、HEPES 緩衝液 (Corning、1%)、およびペニシリン - ストレプトマイシン (Gibco、 1%）。 ホタルルシフェラーゼ + CD19 + NALM6 細胞は、FBS (10%)、ピルビン酸ナトリウム (1%)、HEPES 緩衝液 (1%)、ペニシリン - ストレプトマイシン (1%)、非必須アミノ酸 (Gibco、 1%) および 2-メルカプトエタノール (0.1%)。

活性化の 2 日後、3 人のドナーからの CD3+ T 細胞をエレクトロポレーションまたは A5K ペプチドを使用して Cas12a TRAC-RNP で編集し、CAR AAV で形質導入しました。 他の T 細胞には gRV を形質導入するか、編集しませんでした。 編集の6日後にフローサイトメトリーを実施し、CAR+パーセンテージおよびA549細胞と共培養するT細胞の数を決定しました（エフェクター細胞と標的細胞の比は約1：1）。 12 時間間隔で、T 細胞を前の共培養物から取り出し、新しいプレプレーティング標的細胞に合計 4 ラウンド播種しました。 各編集条件の他の T 細胞は、標的細胞なしで培養されました。 その後、フローサイトメトリーを実施してCAR+、CD4+、CD8+の割合とCD62L/CD45RA表現型を決定し、NALM6標的細胞を用いた細胞毒性アッセイでT細胞を評価しました。

反復刺激実験のアッセイでは、反復刺激を受けたまたは受けていない、または未処理の 3 つの異なる CAR 送達方法によって編集された T 細胞を使用しました。 インビボ実験に対応するアッセイでは、A5K またはエレクトロポレーションを使用して TRAC-CAR ノックインおよび B2M ノックアウト用に連続的に編集された T 細胞、または未処理の T 細胞を使用しました。

7 つの 2 倍連続希釈 T 細胞を 96 ウェル平坦透明底プレート (Thermo Fisher Scientific #165306) にプレーティングし、最初のウェルセットに 5 × 104 CAR+ (または未処理) T 細胞を入れました。 合計 5 × 104 個の NALM6 細胞を各ウェルに追加しました。 培地は X-VIVO 15、ヒト血清 (5%)、ペニシリン - ストレプトマイシン (0.5%)、IL-7 (5 ng ml-1) および IL-15 (5 ng ml-1) であり、1 あたりの総量はウェルは100μlでした。 最大シグナルのコントロールは NALM6 細胞で、最小シグナルのコントロールは NALM6 細胞と Tween-20 (0.2%) でした。 共培養物を３重に播種し、約２４時間インキュベートした。 次に、100μlのd-ルシフェリン（GoldBio、0.75mg ml-1）を各ウェルに添加し、GloMAX Explorerマイクロプレートリーダー（Promega）を使用して発光シグナルを測定した。 細胞毒性は、100% × (1 − (サンプル − 最小値)/(最大値 − 最小値)) として計算されました。 平均値の標準誤差 (sem) の計算時に誤差が伝播しました。

Dynabead 活性化の 2 日後、CD3+ T 細胞をエレクトロポレーションまたは A5K ペプチドを使用して Cas9 TRAC-RNP で編集し、CAR AAV で形質導入しました。 2日後、エレクトロポレーションまたはA5Kペプチドを使用してCas9 B2M-RNP編集を実行しました。 最初の編集から 6 日後にフローサイトメトリーを実施しました。

NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) マウスは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校 (UCSF) 施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコール AN194345-01E に従って倫理的に扱われました。 実験前および実験中、マウスにはクラバモックス抗生物質を投与した。 合計 5 × 105 個の NALM6 細胞を、生後 8 ～ 12 週目のマウスの尾静脈に注射しました。 最初の BLI 測定後 (NALM6 注射後かつ T 細胞注射前)、条件全体で同様の平均質量と腫瘍量を維持するために、マウスを各 T 細胞条件に割り当てました。 NALM6 注射の 4 日後、連続編集を受けた 2 × 105 個または 4 × 105 個の CAR+ T 細胞 (細胞数は B2M ノックアウト率とは無関係に、CAR ノックインに基づいています) または 4 × 105 個の未処理 T 細胞を注射しました。尾静脈。 マウスの健康状態と生存率を経時的に監視しました。 BLI は、Xenogen in vivo イメージング システムを使用して週に 1 ～ 2 回実行されました。 各イメージングセッションで、マウスにルシフェリン(0.2 ml DPBSあたり3 mgのルシフェリン)を腹腔内注射し、イソフルラン(Medline Industries)で麻酔した。 デフォルトのイメージング露光は 1 分で、1 分で信号が飽和する画像にはより短い露光が使用されました。 発光は、Living Imageソフトウェア(PerkinElmer)を使用して定量化した。 報告された BLI 値は、各マウスの前面と背面のイメージングからの平均です。 マウスは、運動能力の喪失やその他の疾病の兆候などのエンドポイントに達した場合、承認されたプロトコルに従って安楽死させられました。

CD4+ T 細胞は、AAVS1 を標的とする Cas9 RNP で編集されました。 この遺伝子座を標的とする決定により、TCR などの細胞成分を破壊する影響を及ぼさずに、RNA レベルに対する影響を比較対象の送達方法に起因させることが可能になります。 RNeasy Micro キット (Qiagen #74004) を使用して、3 つの時点 (編集後 6 時間、1 日、および 7 日後) で 4 人のドナーからの処理細胞 (未処理、DMSO、A5K、エレクトロポレーション) から RNA を抽出し、NanoDrop を使用して定量しました。 -80 °C で保存しました。 RNA サンプルは、NanoString CAR-T 特性評価パネルを使用した nCounter 分析のために、UCSF-HDFCCC Laboratory for Cell Analysis の共有リソース施設に提出されました。 火山プロットの遺伝子発現倍率変化とベンジャミニ・イェクティエリ調整 P 値は、nSolver 解析ソフトウェアを使用して決定されました。 対象となる各治療比較について、各時点について個別に、およびすべての時点を含めて分析を実行しました。 後者のアプローチでは、より多くのデータを入力として使用するため、重大な影響を受けた遺伝子を特定する際の感度が高くなります。 この理由から、そして時点固有の結果への偏りが少ないため、この分析に焦点を当てました。 プロットは MATLAB で生成されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究の結果を裏付けるデータは、論文およびその補足情報から入手できます。 配列データは、BioProject ID PRJNA923785 で NCBI SRA から入手できます。 Cas9 プラスミドは、Addgene (ID# 196245 および 196246) で入手できます。 前処理された nCounter データを含むすべてのデータは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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S. Pyle と研究著者らは、もともと Two Photon Art の C. Liu が作成した Innovative Genomics Institute Glossary Icon Collection から CRISPR 酵素の図を採用しました。 QB3 Berkeley MacroLab の C. Jean 氏の支援に感謝します。 この原稿に関してコメントをくださった ML Hochstrasser に感謝いたします。 DVF は、カナダ保健研究所の研究フェローシップによってサポートされています。 JJM は、がん研究所アービントン博士研究員フェローシップによって支援されています。 DNN は、NIH 助成金 L40AI140341 および K08AI153767、UCSF LGR イノベーション賞、および以前は CIRM Alpha Stem Cell Clinic フェローシップによって支援されています。 VSV は、UCSF 多発性骨髄腫トランスレーショナル イニシアチブによって支援されました。 BRS は、UCSF ハーバート パーキンス細胞療法および輸血医学フェローシップ、CIRM アルファ幹細胞クリニック フェローシップ、および NCATS からの NIH LRP 助成金によってサポートされています。 AM、SUS、および RCW は、体細胞ゲノム編集 (SCGE) コンソーシアムの一環として、NIH 賞 UG3AI150552 によってサポートされています。 VA は、Fondation ARC pour la recherche sur le cancer によって支援されています。 AM は、シモンズ財団、がん研究所、パーカーがん免疫療法研究所、革新的ゲノミクス研究所からのロイド J. オールド STAR 助成金によって支援されています。 UCSF Parnassus Flow Core RRID:SCR_018206 は、DRC Center Grant NIH P30 DK063720 によってサポートされています。 NanoString nCounter データは、NIH 助成金 P30CA082103 によってサポートされている HDFCCC Laboratory for Cell Analysis Shared Resource Facility と協力して取得されました。 A549 細胞は、Kole Roybal 研究所から提供されました。

これらの著者は同様に貢献しました: Dana V. Foss、Joseph J. Muldoon、David N. Nguyen。

革新的ゲノミクス研究所、カリフォルニア大学バークレー校、米国カリフォルニア州バークレー

ダナ・V・フォス、デヴィッド・N・グエン、ダニエル・カー、スリシュティ・U・サフ、ジョン・M・ハンシンガー、ステイシア・K・ワイマン、ネトラヴァティ・クリシュナッパ、リマ・メンドンサ、エレイン・V・シャンツァー、アレクサンダー・マーソン＆ロス・C・ウィルソン

カリフォルニア大学バークレー校、分子細胞生物学部、米国カリフォルニア州バークレー

ダナ・V・フォス、デヴィッド・N・グエン、スリシュティ・U・サフ、ジョン・M・ハンシンガー、リマ・メンドンサ、エレイン・V・シャンツァー、ロス・C・ウィルソン

カリフォルニア大学バークレー校カリフォルニア定量生物科学研究所、米国カリフォルニア州バークレー

ダナ・V・フォス、スリシュティ・U・サフ、ジョン・M・ハンシンガー、リマ・メンドンサ、ロス・C・ウィルソン

グラッドストーン-UCSF ゲノム免疫研究所、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

ジョセフ・J・マルドゥーン、デヴィッド・N・グエン、ダニエル・カー、ブライアン・R・シャイ、ヴィヴァスヴァン・S・ヴィクンタ、ヴィンセント・アレイン、ジョンメイ・リー、アレクサンダー・マーソン、ジャスティン・エイケム

カリフォルニア大学サンフランシスコ医学部、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

ジョセフ・J・マルドゥーン、デヴィッド・N・グエン、ダニエル・カー、ブライアン・R・シャイ、ヴィヴァスヴァン・S・ヴィクンタ、ヴィンセント・アレイン、アレクサンダー・マーソン、ジャスティン・エイケム

カリフォルニア大学サンフランシスコ校検査医学科、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

ブライアン・R・シャイ

パリ大学、INSERM UMR976、サンルイ病院、パリ、フランス

ヴィンセント・アレイン

パーカー癌免疫療法研究所、カリフォルニア大学サンフランシスコ校、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

アレクサンダー・マーソン & ジャスティン・エイケム

カリフォルニア大学サンフランシスコ校、微生物学および免疫学部、米国カリフォルニア州サンフランシスコ

アレクサンダー・マーソン & ジャスティン・エイケム

カリフォルニア大学サンフランシスコ糖尿病センター、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

アレクサンダー・マーソン

UCSF ヘレン・ディラー・ファミリー総合がんセンター、カリフォルニア大学サンフランシスコ校、米国カリフォルニア州サンフランシスコ

アレクサンダー・マーソン & ジャスティン・エイケム

カリフォルニア大学サンフランシスコ人類遺伝学研究所、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

アレクサンダー・マーソン & ジャスティン・エイケム

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DVF、JJM、DNN、AM、JE、RCW がこの研究を発案しました。 DVF、JJM、DNN、DC、SUS が実験を設計、実行し、データを分析しました。 JMH と RM は試薬を考案し、準備しました。 SKWがデータを分析しました。 NK、EVS、ZL が実験を行いました。 BRS、VSV、VA は実験計画に貢献しました。 DVF、JJM、DNN、DC、SUS、AM、JE、RCW が原稿を執筆および編集しました。 著者全員が原稿を読み、その内容に同意します。

アレクサンダー・マーソン、ジャスティン・エイケム、またはロス・C・ウィルソンとの通信。

DVF、DNN、DC、SUS、JMH、AM、および RCW が、この研究に関連する特許出願の発明者として指名されています。 DNN は、この研究に関連する特許を所有していますが、この研究から生じたものではありません。 DNN は Navan Technologies のコンサルタントであり、株式を所有しています。 BRS と AM は、この研究に関連する特許を所有していますが、この研究から生じたものではありません。 JE は、Mnemo Therapeutics の有償共同創設者であり、Cytovia Therapeutics の有償科学顧問であり、Mnemo Therapeutics と Cytovia Therapeutics の株式を所有し、Treefrog Therapeutics の科学諮問委員会の有償メンバーであり、Casdin Capital からコンサルティング料を受け取っています。 。 JE研究所は、Cytovia Therapeutics、Mnemo Therapeutics、および武田薬品から研究支援を受けています。 JE は、この研究に関連する特許を所有していますが、この研究から生じたものではありません。 AM は、Arsenal Biosciences、Spotlight Therapeutics、Survey Genomics の共同創設者であり、Spotlight Therapeutics と Survey Genomics の取締役を務めており、Arsenal Biosciences の取締役会オブザーバー (および元取締役会メンバー) であり、メンバーでもあります。アーセナル・バイオサイエンス、スポットライト・セラピューティクス、サーベイ・ゲノミクス、ニューリミットおよびアムジェンの科学諮問委員会の一員であり、アーセナル・バイオサイエンス、スポットライト・セラピューティクス、ニューリミット、サーベイ・ゲノミクスおよびPACTファーマの株式を所有し、アーセナル・バイオサイエンス、スポットライト・セラピューティクス、ニューリミット、23andMeから手数料を受け取っている。 、PACT Pharma、Juno Therapeutics、Trizell、Vertex、Merck、Amgen、Genentech、AlphaSights、Rupert Case Management、Bernstein、ALDA。 AM は Offline Ventures の投資家および非公式アドバイザーであり、EPIQ の顧客でもあります。 AM 研究所は、Juno Therapeutics、Epinomics、Sanofi、GlaxoSmithKline、Gilead、Anthem から研究支援を受けています。 RCW 研究所は、ジェネンテック、ロシュ、ファイザーから研究支援を受けています。 関連する研究は、ここで報告されているものとは異なります。

Nature Biomedical Engineering は、この研究の査読に貢献してくれた Meisam Kararoudi と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

補足の図と表。

ソースデータ。

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転載と許可

フォス、DV、マルドゥーン、JJ、グエン、DN 他初代ヒトリンパ球の効率的な編集のための CRISPR 酵素のペプチド媒介送達。 ナット。 バイオメッド。 Eng 7、647–660 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41551-023-01032-2

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受信日: 2022 年 1 月 24 日

受理日: 2023 年 3 月 26 日

公開日: 2023 年 4 月 25 日

発行日：2023年5月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01032-2

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